一、概要
阿维菌素类药物（AVMS）属于大环内酯类抗生素，其作为一种抗寄生虫药物而被广泛应用，由于高效液相色谱分析法和气相色谱等仪器分析方法样本前处理及测定操作烦琐和费用高，推广使用受到限制。ELISA方法具有灵敏度高，仪器化程度低，操作简便而便于普及。
二、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物阿维菌素类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争类阿维菌素药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物阿维菌素类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物阿维菌素类药物的含量。
三、使用范围
用于定量、定性检测牛组织（牛肉、牛肝）中阿维菌素类药物的残留量。
四、交叉反应率
阿维菌素 …………………………100%
埃普菌素 …………………………130%
依维菌素 …………………………33%
多拉菌素…………………………<10%
五、试剂盒的组成
每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中材料如下：
1、 96孔板酶标板1块
2、标准液6瓶，为AVM标准溶液 1mL/瓶：
0µg/L， 0. 5µg/L，1.5µg/L，4.5µg/L，13.5µg/L，40.5µg/L
3、酶标记物12mL …………………………………………红色帽
4、阿维菌素类药物抗体10mL………………………………蓝色帽
5、显色液 A液 7mL ………………………………………白色帽
6、显色液 B液 7mL ………………………………………红色帽
7、终止液（2M硫酸）7mL ……………………………… 黄色帽
8、20X浓缩洗涤液 40mL ………………………………透明帽
9、2X浓缩复溶液50mL ……………………………………透明帽
六、所用仪器、试剂
1. 仪器：
微孔板酶标仪450nm/630nm
旋转蒸发仪
组织均质器
振荡器
离心机
20µL-200µL微量加样器、100µL-1000µL微量加样器
2. 试剂：
甲醇
去离子水
七、溶液的配制
1. 稀释复溶液：将2X浓缩复溶液摇匀，用水以1：2比例稀释，临用前配制。
2. 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20比例稀释，临用前配制。
八、样本前处理步骤
1. 牛组织（肌肉、肝脏）样本处理方法
1.1 取牛组织（肌肉、肝脏）进行均质。
1.2 称取2±0.05g牛肉，加入8mL乙腈，震荡提取20min，3000g以上离心10min，取上清液5mL备用。
1.3 取sep-pak vac12cc(2g)柱，称取3g无水硫酸钠平铺在滤板上，加入10mL乙腈溶液。
1.4 加入提取液5mL，收集滤液，待提取液流干，再加入4mL乙腈清洗残留液。
1.5 将收集滤液置60℃下氮气吹干，加入1mL复溶液复溶。
1.6 取20μL进行分析。
九、检测步骤
使用前将试剂盒置于室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃不要冷冻。
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2~8℃不要冷冻。
3、用加样器每孔加标准品或样本20mL 后，每孔再加80mL的抗体溶液。
4、用盖板膜盖板后置于37℃环境反应30min。
5、小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液每孔250mL充分洗涤4~5次，每次间隔10~20 s，用吸水纸拍干。
6、加酶标记物：每孔加入100mL。用盖板膜盖板后置37℃环境反应30min，取出重复洗板步骤。
7、显色：每孔加入底物液A液50mL，再加底物液B液50mL，轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。
8、测定：每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔OD值。
十、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含阿维菌素类药物量成负相关。
1、用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(µg/L)。假设样品1的吸光度值为0.301, 样品2的吸光度值为0.812, 标准品吸光度值分别是：0µg/L为1.500；0. 5µg/LL为1.280；1.5µg/L为1.080；4.5µg/L为0.710； 13.5µg/L为0.405；40.5µg/L为0.250。则样品1的浓度范围是13.5 -40.5µg/L; 样品2的浓度范围是1.5 -4.5µg/L。
2、所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
以阿维菌素类药物浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度:0.5µg/L，标准曲线IC50在2.32µg/L ~4.57µg/L范围之内。
试剂盒变异系数：小于25%。
回收率：回收率范围在60.0%~120.0%之间。
样本最低检测限：
牛肉………………………………1.2µg/kg
牛肝………………………………2.7µg/kg
十二、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、保存试剂盒于2~8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。
十三、储存条件及保存期
储存条件：保存试剂盒于2~8℃。
保存期：该产品保存期为6个月。
十四、供应商名称、地址
供应商：北京望尔生物技术有限公司
地址：北京市海淀区圆明园西路2号
