一、概要
恩诺沙星，是氟喹酮类抗菌药，因其抗菌广谱、抗菌作用强、口服吸收好、体内分布广，现已成为畜禽业和水产养殖业中最重要的抗菌类药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长。由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟及我国均制定了在组织中的最高残留限量（100µg/kg）。
鸡的代谢研究表明，恩诺沙星在鸡体内的残留消除缓慢，主要代谢物为恩诺沙星原型和环丙沙星。恩诺沙星主要滞留在肌肉、肝脏和肾脏中。恩诺沙星的排泄主要通过肾脏，其次通过胆汁排出。鸡体内的恩诺沙星消除较缓慢，以30µg/L为恩诺沙星在食用组织中允许残留标准时，其休药期为12天。
目前对恩诺沙星的检测方法主要有荧光分光光度法、酶联法（ELISA）和液相色谱法等。ELISA以其灵敏度高、操作简便等优点现已成为常规筛选方法。
二、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物恩诺沙星将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗恩诺沙星抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物恩诺沙星的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物恩诺沙星的含量。
三、使用范围
用于定量、定性检测鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾、鱼和鸡血中ENR残留量。
四、交叉反应率
恩诺沙星…………………………100％
环丙沙星…………………………1.35％
诺氟沙星…………………………1.75％
氧氟沙星…………………………<0.01％
沙拉沙星…………………………<0.01％
二氟沙星…………………………<0.01％
依诺沙星…………………………<0.01％
左氧氟沙星………………………<0.01％
司帕沙星…………………………<0.01％
培氟沙星…………………………<0.01％
五、试剂盒组成
每一个盒中的试剂足够进行96个孔测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：
1. 96孔酶标板1块
2. 标准液X6瓶，1mL/瓶，为恩诺沙星标准溶液： 0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L
3. 酶标记物 12mL……………………红色帽
4. 恩诺沙星抗体 7mL……………………绿色帽
5. 显色液A液 7mL ……………………白色帽
6. 显色液B液 7mL ……………………红色帽
7. 终止液 7mL……………………黄色帽
8. 浓缩洗涤液 40mL
六、所用仪器、试剂
1. 仪器
微孔板酶标仪450nm/630nm
匀质器
振荡器
离心机
20µL-200μL；100µL-1000μL微量加样器
2. 试剂
乙腈
正己烷
二氯甲烷
氢氧化钠
磷酸氢化钠
磷酸二氢钠
七、溶液的配制
1. 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用去离子水以1：20比例稀释，临用前配制。
2、0.1MNaOH溶液 0.4g NaOH
去离水100ml溶解
3、乙腈NaOH溶液 将乙氰与0.1M NaOH溶液按84：16的体积比混合
4、PB缓冲液配制 0.52g Na2HPO4·12H2O
0.088g NaH2PO4·2H2O
去离水100ml溶解
八、样本前处理步骤
1. 鸡组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法
1.1 称2.0g均质过的鸡肉样本于50mL离心管中；
1.2 加入乙腈NaOH溶液10mL。充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min；
1.3 取出5mL上清液，加入PB缓冲液2mL，混合均匀；
1.4 加入二氯甲烷5mL，充分混匀10min，3000g以上, 15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或氮气吹干；
1.5 0.6mL PB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，3000g以上, 15℃离心5min（若下层有混浊，请重复加入正己烷去脂）；
1.6 轻吸掉上层有机相和中间部份液体，取下层50μL溶液，再加入150μLPB缓冲液混匀即可分析。
注：样本被稀释4倍
2. 水产品样本的提取等同于鸡组织样本的提取方法。
注：水产品提取中上述第1.6步，如果在两相之间出现太多的泡沫或胶状物，难以取出足够的下层提取液，应将样品瓶放在80℃水浴中5min后再离心。
3. 鸡血清样本处理方法
3.1 用加有肝素钠（20-30单位/mL血）的离心管采集血样本，血样本室温静置1h，待析出血清后3000g, 15℃离心10min，取出血清1mL。
3.2 加入3mL乙腈（不含水）充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min。转移上清至另一离心管中，加入1mLPB缓冲液，混匀；
3.3 加入二氯甲烷4mL，充分混匀10min，3000g以上, 15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干/氮气吹干；
3.4 用0.6mL PB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上, 15℃离心5min；
3.5 轻吸掉上层有机相和中间白色杂质，取下层50μL溶液，再加入150μLPB缓冲液混匀即可分析。
注：样本被稀释4倍
九、 九、检测步骤
1、将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（2024℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、按需要取好微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷冻。
3、编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。
4、加标准品或样本 50 mL /孔，然后加抗体工作液50 μL/孔，用盖板膜盖板，37℃水浴或恒温箱反应30min。
5、取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4－5次，每次浸泡10秒，拍干。
6、加酶标记物工作液，每孔100mL，用盖板膜盖板后置37℃水浴或恒温箱反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4－5次，每次浸泡10秒，拍干。
7、显色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃水浴或恒温箱避光显色15min。
8、测定：每孔加入2M终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。
十、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含恩诺沙星成负相关。
1、均吸光度值与标准品比较即可得出其浓度范围。假设样品1的吸光度值为0.350, 样品2的吸光度值为0.852, 标准液吸光度值分别是：0µg/L为1.500；0.5µg/L为1.280；1.5µg/L为1.080； 4.5µg/L为0.750；13.5µg/L为0.410； 40.5µg/L为0.251。则样品1的浓度范围是13.5µg/L-40.5µg/L; 样品2的浓度范围是1.5µg/L-4.5µg/L。
2、定量测定
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以恩诺沙星标准品浓度（µg/L）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中恩诺沙星实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度： 0.30µg/L，标准曲线IC50在1.45～3.26µg/L范围之内。
试剂盒精密度：变异系数小于25%。
试剂盒准确度：样本的回收率均在60.0%～110.0%之间。
样本最低检测限
鸡肉……………………………1.0µg/kg
鸡肝……………………………1.4µg/kg
血清……………………………2.2µg/L
虾………………………………1.5µg/kg
鱼肉……………………………1.0µg/kg
十二、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象：显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。零标准的吸光度值小于0.6个单位（OD450nm<0.6 ）时，表示试剂可能变质。
8、加A、B 液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30min。
十三、储存条件及保存期
储存条件：保存试剂盒于2~8℃。
保存期：该产品保存期为6个月。
十四、供应商名称、地址
供应商：北京望尔生物技术有限公司
