一、概要
氟喹诺酮类(QNS)药物是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素，能抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强。已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长。由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量。尤其是我国出口到日本的鳗鱼，氟喹诺酮类药物的残留检测已成为一个必检项目。
在组织中，恩诺沙星的标示残留物为环丙沙星，其中以肝脏组织和肾脏组织中的残留物浓度最高，其次是肌肉和脂肪附着的皮肤组织，恩诺沙星其代谢产物环丙沙星（CIF）仍具有生物活性。氧氟沙星（OFL）其主要以原形药物的形式存在于组织中；洛美沙星（LOM）在体内代谢率相当高，接近100%的代谢率，而其代谢产物是诺氟沙星（NOR）。
二、原理
试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氟喹诺酮类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氟喹诺酮类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留氟喹诺酮类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物氟喹诺酮类药物的含量。
三、使用范围
用于定量、定性检测对鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾、血清等样本中氟喹诺酮类药物的残留量。
四、交叉反应率
恩诺沙星……………………………83.3%
环丙沙星………………………………100%
诺氟沙星………………………………166.7%
氧氟沙星………………………………125%
洛美沙星………………………………76.9%
五、试剂盒的组成
每一个盒中的试剂足够进行96个孔测量(包括标准分析孔)，盒中的材料如下：
1、96孔板酶标板 1块
2、标准溶液6瓶（1mL/瓶）：
0µg/L，1 µg/L, 3 µg/L，9 µg/L，27 µg/L，81 µg/L
3、酶标记物 12mL ……………………………红色帽
4、氟喹诺酮类药物抗体 10mL……………………绿色帽
5、底物液 A液 7mL ……………………………白色帽
6、底物液 B液 7mL………………………………红色帽
7、终止液 7mL ………………………………黄色帽
8、20X浓缩洗涤液40mL
9、2X浓缩复溶液50mL
六、所用仪器、试剂
1、仪器
酶标仪（450nm/630nm）
旋转蒸发仪
组织均质器
振荡器
离心机
微量加样器：20µL-200µL 、100µL-1000µL
2、试剂
以下所有试剂，水为蒸馏水
乙腈－NaOH；正己烷；二氯甲烷
七、溶液的配制
1. PB溶液的配制：称取磷酸氢二钠2.58g磷酸二氢钠0.44g溶于500ml去离子水中。
2. 稀释浓缩复溶液：将2X浓缩复溶液摇匀，用水以1：2的比例稀释，临用前配制。
3. 稀释浓缩洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20倍稀释，临用前配制。
八、样本前处理步骤
1．动物组织（肌肉、肝脏等）、虾样本处理方法
1.1 称2.0g均质过的鸡肉样本于50mL离心管中。
1.2 加入乙腈－NaOH溶液10mL。充分混合10min，3000g或以上，15℃离心10min。
1.3 取上层液5mL，加入5mL的PB缓冲液，再加入正己烷4mL，混合2min，3000g以上15℃离心10min，除去上层有机相。
1.4 加入二氯甲烷8mL，充分混匀10min，3000g或以上，15℃离心10min。去上层，取下层有机相移到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或用氮气吹干。
1.5用0.6mL 稀释了的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min， 3000g或以上，15℃离心5min。
1.6 轻吸掉上层有机相和中间部份液体，取下层50mL+50mL稀释了的复溶液混匀即可分析。
2. 鸡血样本的处理
2.1 用加有肝素钠（20-30单位/mL血）的离心管采集鸡血样本（采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置1h，待析出血浆后3000g以上，15℃离心10min，取出血浆/血清1mL。
2.2 加入乙腈4mL充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min。
2.3 移上清至另一离心管中，加入2mLPB缓冲液，混匀。
2.4 加入二氯甲烷5mL，充分混匀10min，3000g以上，15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或用氮气吹干。
2.5 用0.6mL 稀释了的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min， 3000g以上，15℃离心5min。
2.6 轻吸掉上层有机相和中间白色杂质，取下层50mL和50mL稀释了的复溶液混匀即可分析。
九、检测步骤
使用前将试剂盒置于室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃不要冷冻。
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔条重新密封，保存于2~8℃。
3、编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。
4、加标准品或样本 50mL，然后各加入抗体工作液50mL，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min。
5、取出用稀释后的洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10s，用吸水纸拍干。
6、加酶标记物，每孔100mL，用盖板膜盖板，置37℃环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。
7、显色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。
8、测定：每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。
十、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氟喹诺酮类药物量成负相关。
1、用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围。假设样品1的吸光度值为0.301, 样品2的吸光度值为0.812, 标准品吸光度值分别是：0µg/L为1.500；0. 5µg/L为1.280；1.5µg/L为1.080；4.5µg/L为0.710； 13.5µg/L为0.405；40.5µg/L为0.250。则样品1的浓度范围是13.5 -40.5µg/L; 样品2的浓度范围是1.5 -4.5µg/L。
2、所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
以环丙沙星浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：1µg/L，标准曲线IC50在3.93µg/L ~5.49µg/L范围之内。
试剂盒的变异系数：小于25%。
准确度：回收率范围在50%~130.0%之间。
样本最低检测限：
鸡肉………………………………2.9µg/kg
鸡肝………………………………3.0µg/kg
血清………………………………2.8µg/kg
虾…………………………………2.7µg/kg
十二、注意事项：
1、室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、保存试剂盒于2~8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。
十三、储存条件及保存期
储存条件：保存试剂盒于2~8℃。
保存期：该产品保存期为6个月。
十四、供应商名称、地址
供应商：北京望尔生物技术有限公司
地址：北京市海淀区圆明园西路2号
