一 、原理：

测定的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有四环素包被抗原，同时加入标样或试样及兔抗四环素特异性抗体，标样或试样中的四环素与包被抗原竞争兔抗四环素抗体上有限的结合位点，通过洗涤除去没有与包被抗原结合的抗四环素抗体。再加入酶标羊抗兔抗体，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物，吸光度值与试样中四环素、金霉素土霉素及多西环素浓度成反比。

二、使用范围

本试剂盒适用于牛奶、鸡、鱼、猪和牛组织中四环素、金霉素、土霉素和多西环素残留量的快速筛选检测。

三、交叉反应率

四、使用单位需自备的设备及试剂

以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为双蒸水。

天平               精度0.01g

酶标仪           （配备450nm滤光片）

匀浆机  

漩涡振荡器和微孔板振荡器

冷冻离心机

微量移液器     50µL，100µL，1000µL，八道250µL

C₁₈固相萃取柱   1mL100mg含碳量≥17%

 针式过滤器    0.22nm

甲醇

草酸

柠檬酸钠

磷酸氢二钠

已二胺四乙酸二钠

氢氧化钠

三氯乙酸

五、提供的材料与试剂：

96孔板            1块

标准溶液浓缩液    6瓶  稀释后浓度分别为0，0.3，1，3，10，30µg/L（1mL/瓶）

酶结合物浓缩液    1瓶  （1.5 mL）

抗体浓缩液        1瓶  （1 mL）

底物              1瓶  （1.5 mL）

缓冲溶液1         1瓶  （25 mL）供稀释试样或标准溶液时使用

缓冲溶液2         1瓶  （25 mL）10倍稀释后供稀释酶结合物、抗体以及洗板时使用

缓冲溶液3         1瓶  （15 mL） 稀释底物时使用

终止液            1瓶  （15 mL）

盖板膜            1张

六、溶液的配制

1、20mmol/L草酸甲醇溶液：称取草酸1.8克，加甲醇900mL溶解，稀释至1000mL。

2、MCI缓冲液：称取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠10.9g，已二胺四乙酸二钠37.2g，加水900mL溶解，调pH值至3.8，稀释至1000mL。

3、1mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠40g溶于1000mL水中，混匀。

4、3%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸30g溶于1000mL水中，混匀。

5、稀释标准溶液：分别吸取各浓度的标准溶液各50µL，分别加入450µL缓冲液1混匀。

6、洗液：将缓冲液2稀释10倍（做整块板时，取20mL浓缩缓冲液2，加水180mL，混匀），作为洗板及稀释抗体和酶结合物时使用。

7、稀释抗体浓缩液：用洗液将抗体浓缩液10倍稀释（做整块板时，取抗体浓缩液0.5mL，加4.5mL洗液，混匀）。

8、稀释酶结合物浓缩液：用洗液将酶结合物浓缩液10倍稀释（做整块板时，取酶结合物浓缩液1mL，加9mL洗液，混匀）。

9、底物溶液的配制：用缓冲液3稀释底物10倍（做整块板时，先取9mL缓冲液3，后加入底物1mL，混匀），根据需要的量现用现配，底物溶液变蓝时禁止使用。

七、样品的前处理

1、牛奶：新鲜的牛奶或冻融的牛奶用缓冲液1稀释10倍作为试样溶液供酶联免疫法测定（50µL牛奶样品，加450µL缓冲液1）。

2、组织提取方法1（鸡肌肉）：

称取匀质（以10000r/min匀浆1min）的肌肉2.0g，加入MCI缓冲液8.0mL，于漩涡振荡器上混匀，颠倒振荡30min，以10000r/min离心10min，取上清液备用（如上清液仍然浑浊，可用滤纸过滤）。

依次用无水甲醇3mL、水2mL活化C₁₈固相萃取柱。取备用液5.0mL过柱，再用水2mL淋洗萃取柱，将萃取柱挤干。用20mmol/L草酸甲醇溶液1.0mL洗脱，收集洗脱液，挤干萃取柱。将洗脱液摇匀，用缓冲液1稀释10倍作为试样溶液供酶联免疫法测定（吸取洗脱液50µL，加入450µL缓冲液1，摇匀）。

3、组织提取方法2（鱼肉、猪、牛组织）

称取匀质（以10000r/min的速度匀浆1min）的组织1.0g，加入3%三氯乙酸（鱼肉、猪肉和牛肉4mL，猪肝和牛肝8mL），旋涡混匀，颠倒振荡20min，以10000r/min离心10min，取上清液200µL于1.5mL离心管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液20µL，混匀，加入缓冲液1 780µL混匀，以8000 r/min离心5min，上清液备用。

八、检测步骤

1、使用前将试剂盒恢复置室温（18~37℃）。

2、剪开锡箔袋，取所需微孔板条的数量，插入框架。

3、向微孔中加入标准溶液或试样溶液50µL，每孔加入稀释的抗体50µL，在微型震荡器上充分混匀后，用封口膜封好，室温孵育1h。

4、倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。加洗液250µL到酶联板的微孔内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板三次。

5、加入稀释的酶结合物100µL，室温孵育30min。

6、重复步骤4。

7、加底物溶液100µL，室温避光孵育5~15min。

8、每孔加终止液100µL，于450nm波长处测定吸光度值，60min内读数。

九、结果判定

按下式计算百分吸光度值：

B—为标准溶液或样品的平均吸光度值。

B₀—为0浓度的标准溶液平均吸光度值。

以标准溶液中四环素浓度的对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，根据标准曲线计算试样溶液中四环素类药物的浓度。  

十、检测方法灵敏度、准确度、精密度

1、灵敏度

各组织中四环素类药物的检测限均可达13µg/L（kg）以下。

2、准确度

在100µg/L添加浓度的回收率为40~120%。

3、精密度

本方法的批内变异系数CV£25%，批间变异系数CV£25%。

十一、注意事项

1、试剂盒在使用前应使微孔板及所有试剂回复至室温，整个试验应在18~37℃完成。不用的微孔板条应立即放回原锡箔袋中，密封。放回2~8℃保存。

2、稀释了的抗体、酶结合物、标准液及底物溶液不稳定，应现用现配，底物溶液应避光保存。

3、加抗体和洗板时吸头不可接触到酶联板中的液体。

十二、储藏条件和保存期

     2~8℃保存，保存期为6个月。

十三、供应商名称、地址

中国兽医药品监察所

北京中关村南大街8号

邮  编：100081

电话：010－62158844转3382