一、概要
磺胺药物是应用广泛的抗菌素，曾对畜禽疾病控制和治疗起了重要作用。但由于磺胺类药物存在严重副作用，人体中长期存在磺胺药物会导致许多细菌对磺胺药物产生抗药性，且有潜在的致癌性，已被多个国家规定限量或禁止使用。由于高效液相色谱分析法等仪器分析方法样本前处理及测定操作烦琐和费用高，推广使用受到限制。ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器化程度低和样本前处理相对简单等优点，适用于现场控制和大量样本筛查。
二、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三者的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含磺胺药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出残留物磺胺的含量。
三、使用范围
本试剂盒可用于鸡组织（肌肉、肝脏等）、鸡蛋、尿液、蜂蜜等样本中磺胺类药物的残留检测。
四、交叉反应率
磺胺二甲基嘧啶（SM2）………………100%
磺胺二甲氧嘧啶（SDM）………………23%
磺胺甲基嘧啶（SM1）………………… 12%
五、试剂盒组成
每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：
1. 磺胺类药物多残留96孔酶标板 1块
2. 标准品溶液6瓶，1mL/瓶， 0µg/L，1µg/L，3µg/L，9µg/L，27µg/L，81µg/L
3. 酶标记物7mL ………………………………………………红色帽
4. SAs抗体工作液 10mL………………………………………… 绿色帽
5. 显色液 A液7mL ……………………………………………白色帽
6. 显色液 B液7mL ……………………………………………红色帽
7. 终止液（7mL）：2M硫酸 …………………………………黄色帽
8. 20X浓缩洗涤液40mL
20X浓缩提取液50mL
六、所用试剂、仪器
1、仪器
微孔板酶标仪（450nm/630nm）
旋转蒸发仪
组织均质器
振荡器
离心机
微量加样器20µL-200µL、100µL-1000µL
2、试剂和材料
离子水
乙酸乙酯
乙腈
异辛烷
三氯甲烷
七、溶液的配制
1. 2mol/L NaCl溶液：称取11.69gNaCl 加入100mL水溶解。
2. 稀释提取液：将2X浓缩提取液摇匀，用水以1：2的比例稀释，临用前配制。
3. 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20的比例稀释，临用前配制。
八、样本前处理步骤
1. 鸡组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法
1.1 取肌肉用匀浆机10000r/min匀浆1 min，称取5±0.05g匀浆物置离心管中，加入15mL乙腈-水溶液（84+16，v/v）混合，剧烈振荡10min。于15℃，3000g以上速度离心10min。
1.2 取3mL上清液，加入2mL水和5mL乙酸乙酯，混合振荡10min，15℃，3000g以上速度离心5min。
1.3 将上层液移另一管中用氮气吹干（或鸡心瓶中，50℃减压蒸干）
1.4 用异辛烷或正己烷1mL溶解干燥的残留物，加入稀释提取液1mL振荡2min。15℃，3000g，离心5min，除去上层液。
1.5 取20μL水相进行分析。
2. 鸡蛋样本处理方法
样本处理方法同动物组织处理方法。
3. 蜂蜜样本处理方法
称取1g蜂蜜样本于50mL离心管中，加入2mL稀释了的提取液，再加入8mL乙酸乙酯，震荡萃取10min，3000g以上离心10min,取上层液体于50℃下氮气吹干，加1mL稀释提取液复溶，取20mL进行分析。
4. 尿液样本处理方法
4.1 取2mL尿液，加入8mL乙酸乙酯，震荡萃取10min，3000g以上离心10min,取上层液4mL于50℃下氮气吹干，加1mL 稀释提取液复溶。
4.2 取20μL进行分析。
九、检测步骤
1. 将试剂盒从冷藏环境中取出，将所需试剂从试剂盒中取出，置室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2. 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3. 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。
4. 反应：往酶标板微孔中加标准溶液或样本溶液20µL，加酶标记物50µL，然后加入磺胺类抗体工作液80µL，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应1h。倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250µL洗涤液，30S后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。
5. 显色：每孔加入A、B底物液各50µL，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色20-30min。
6. 测定：每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。
十、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含磺胺类药物残留成负相关。
1. 用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围。假设样品1
的吸光度值为0.6，样品2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0µg/L为1.500；1µg/L为1.380；3µg/L为1.200；9µg/L为0.900；27µg/L为0.700；81µg/L为0.400。则样品1的浓度范围是27～81µg/kg(L)；样品2的浓度范围是3～9µg/kg(L)。
2. 所获得的标准值和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的
吸光度值再乘以100%。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值。
计算的标准值绘成为一个对应磺胺类药物浓度的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度可以从校正曲线上读出。
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：1µg/L，标准曲线IC50应在1.64~3.54µg/L的范围之内。
试剂盒变异系数：小于25%。
准确度：样品的回收率范围在65.0%～120.0%之间。
样本最低检测限：
鸡肉…………………………… 1.1µg/kg
鸡肝…………………………… 1.2µg/kg
鸡蛋…………………………… 1.2µg/kg
蜂蜜…………………………… 1.4µg/kg
十二、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、试剂盒于2~8℃保存，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；由于标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。
8、标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。
十三、贮藏条件及保存期
贮藏条件：试剂盒于2~8℃保存，不要冷冻。
保存期：该产品保存期为6个月。
十四、供应商名称、地址
供应商：北京望尔生物技术有限公司
地址：北京市海淀区圆明园西路2号
