一、试验原理

检测的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有亲和纯化的羊抗兔IgG的抗体。反应时加入兔抗克仑特罗特异性抗体于酶联板上，与第二抗体结合而被固定。洗涤除去没有与第二抗体结合的克仑特罗特异性抗体，再加入标准液或样品液与酶结合物竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶结合物。加入底物溶液（四甲基联苯胺），结合到板上的酶结合物将底物转化为蓝色的产物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。在450nm波长处测吸光度，吸光度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

二、使用范围

用于定性和定量检测猪肝和猪尿中克仑特罗残留量。

三、交叉反应

克仑特罗………………………………………100％

沙丁胺醇………………………………………3.6％

班布特罗………………………………………2.2％

福莫特罗………………………………………＜0.1％

盐酸丙卡特罗…………………………………＜0.1％

茶碱……………………………………………＜0.1％

盐酸麻黄碱……………………………………＜0.1％

盐酸肾上腺素…………………………………＜0.1％

3.5－（N.N-二甲胺基甲酰氧基）苯乙酮……＜0.1％

四、使用单位需自备的设备及试剂

以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为双蒸水经离子交换混合柱处理后的去离子水，使用前经0.2µm滤膜过滤。

1．设备与设备

酶标仪（配备450nm滤光片）

天平（精度0.01g）

匀浆机

漩涡振荡器和微孔板振荡器

高速冷冻离心机

微量加样器（单道20µL、50µL、100µL、1000µL各一支,八道250µL一支）

吹干装置

2．试剂

无水甲醇

0.05mol/L盐酸溶液

1mol/L氢氧化钠溶液

磷酸

0.5mol/L磷酸二氢钾缓冲液pH3.0

0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液pH3.0

C₁₈固相萃取柱（1mL 100mg含碳量≥17%）

五、试剂盒提供的材料与试剂

96孔板                      1块（12条×8孔）

标准液 6瓶                   0µg/L,0.1µg/L,0.3µg/L,

1µg/L,3µg/L,9µg/L（1ml/瓶）

酶结合物浓缩液               1瓶  （0.2mL）

抗体浓缩液                   1瓶  （0.2mL）

缓冲液                       1瓶  （25mL）

底物                         1瓶  （1.5mL）

底物缓冲液                   1瓶  （15mL）

终止液                       1瓶  （15mL）

阴性尿液参照品               1瓶  （0.2mL）

阳性尿液参照品(浓度为2µg/L)  1瓶  （0.2mL）

盖板膜                       1张

六、溶液的配制

1．0.05moL/L 盐酸液  取盐酸4.2mL，加水至1000mL。

2．0.05moL/L磷酸盐缓冲液（pH3.0）称取磷酸二氢钾6.8g，加水900mL，

用稀磷酸调节pH至3.0，用水稀释至1000mL。

3．0.5moL/L磷酸盐缓冲液(pH 3.0)  称取磷酸二氢钾68g，加水900mL，

用磷酸调节pH至3.0，用水稀释至1000mL。

4．抗体稀释溶液 将抗体浓缩液摇匀，用缓冲液以1:100的比例稀释抗体

浓缩液，临用前配制。

5．酶结合物稀释溶液 将酶结合物浓缩液摇匀，用缓冲液以1:100的比例

稀释酶结合物浓缩液，临用前配制。

6．底物溶液的配制 用底物缓冲液按1:10的比例稀释底物溶液，临用前配

制。

7．阴性、阳性猪肝参照品：①称取1.0g绞碎空白猪肝按样品处理方法制

备阴性猪肝参照品。②称取1.0g绞碎空白猪肝，加入100µg/L克仑特罗溶液20µL，按样品处理方法制备作为阳性猪肝参照品(浓度为2.0µg/kg)。③阴性、阳性猪肝参照品现配现用。

8．阴性、阳性尿液参照品：①分别用水200µL溶解试剂盒中提供的阴性尿

液参照品和阳性尿液参照品(浓度为2.0µg/L)。②实验剩余的阴性、阳性尿液参照品冷冻保存。

七、样品的前处理方法

1．猪尿样品处理

取适量新鲜或冻融后的猪尿于5000r/min离心10min或过滤，取上清液。

2．猪肝样品处理

提取：称取1.0g±0.05g绞碎组织，置于离心管中，加0.05mol/L盐酸溶液5mL，振荡1.5h，于10~15℃以10000r/min离心15min，上清液转至另一离心管中。加入1mol/L氢氧化钠溶液300µL，混匀。振摇15min，加0.5mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)4mL，混匀，4℃放置1.5h或过夜。再于10~15℃以10000r/min离心15min，上清全部过C₁₈固相萃取柱进一步净化。

净化：用无水甲醇3mL活化C₁₈固相萃取柱，再用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)2mL淋洗萃取柱。将前一步处理好的样品液全部过柱，速度控制约为1mL/min，用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)2mL淋洗萃取柱，空气吹萃取柱1~2min，使萃取柱干燥。将萃取柱移入另一试管上，用无水甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，洗脱液在50~60℃中用氮气或空气缓缓的吹干。残渣用1mL去离子水溶解作为供试试料。如有沉淀，应以10000r/min离心后取上清作为供试试料。

八、检测步骤

1．剪开锡箔袋，按每个标准液和样品提取液2孔计算所需微孔板条的数量，

插入框架。

2．每孔加稀释了的抗体100µL，用封口膜封好，室温孵育30min。

3．倒出孔内液体，在吸水纸上拍打，使孔中没有残留的液体。使用多道移

液器，加250µL水，再倾倒干净。如此洗板，重复三次。

4．加标准液和样品液：

4.1定性检测：

分别取0、1.0µg/L标准液和制备好的样品液20µL到微孔中，每个标准液和样品加双孔。

4.2定量测定：

加系列标准液和样品液20µL到微孔中，每个标准和样品加双孔。

5．每孔加稀释好的酶结合物100µL，在微孔板振荡器上彻底混匀、封好，

室温孵育30min。

6．重复步骤3，洗板三次。

7．每孔加底物溶液100µL，室温避光孵育15min左右。

8．每孔加终止液100µL，混匀。

9．在450nm波长处测吸光度值。60min内读数。

九、结果判定

1．定性测定

以1.0µg/L 浓度的标准液孔的吸光度值为判定标准，样品吸光度值大于该值为阴性，小于或等于该值为可疑。可疑样品用GC-MS法进一步确证。

2．定量测定

所获得的标准和样品吸光度值(B)的平均值除以标准液1吸光度值(B₀)的平均值再乘以100，即百分吸光度值。

   

×100%

百分吸光度值(%)=

×100

               标准或样品吸光度值(B)         

                0标准的吸光度值(B₀)   

        

B—为标准溶液或样品的平均吸光度值。

B₀—为0浓度的标准溶液平均吸光度值。

以克仑特罗浓度的自然对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，在坐标纸上绘制标准曲线图。每一个样品对应的浓度可以从标准曲线上查出。也可以求出回归方程，计算未知样品中克仑特罗的浓度。也可以通过ELISA专业分析软件进行计算。

十、检测方法灵敏度、准确度、精密度

1．灵敏度：

检测限为1.0µg/L（kg）。

2．准确度：

猪尿：在2.0µg/L添加浓度水平上的回收率为60~120%；

猪肝：在2.0µg/kg添加浓度水平上的回收率为40~120%。

3．精密度：

批内、批间变异系数CV≤20%。

十一、注意事项

1．试剂盒在使用前应提前取出，使微孔板及所有试剂回复至室温，整个试验应在19~30℃完成。不用的微孔板条，应立即放回原锡箔袋中密封，放回2~8℃保存。

2．吸标准液及样品20µL时，要尽量准确吸取，放到孔底中央。

3．标准液1吸光度值应大于0.6。

4．稀释了的抗体、酶结合物不稳定，不易保存，现用现配。底物应避光保存。

十二、贮藏条件和保存期

在2~8℃下避光保存，保存期为6个月。

十三、供应商名称、地址

供应商：北京海淀中海动物保健科技公司

地  址：北京市中关村南大街8号

邮  编：100081