一、概要
克仑特罗属于β－兴奋剂，添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长,因其添加量是治疗量的5-10倍，常在动物体内残留而给消费者带来危害。欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。由于气谱色谱等仪器分析方法样本前处理及测定操作烦琐和费用高，推广使用受到限制。ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器化程度低和样本前处理相对简单等优点，适于现场监控和大量样本筛查。
二、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物克仑特罗将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争克仑特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物克仑特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物克仑特罗的含量。
三、使用范围
用于定量、定性检测猪组织（肌肉、肝脏等）和尿液中克仑特罗的残留量。
四、交叉反应率
克仑特罗…………………………100%
沙丁胺醇…………………………10.0%
特布它林…………………………<0.1%
莱克多巴胺………………………<0.1%
福英特罗…………………………<0.1%
盐酸肾上腺素……………………<0.1%
盐酸麻黄碱………………………<0.1%
多巴酚丁胺………………………<0.1%
沙美特罗…………………………<0.1%
五、 试剂盒组成
每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：1. 克仑特罗96孔酶标板 1块
2. 标准液6瓶，1mL/瓶，为克仑特罗标准溶液：0µg/L，0.1µg/L 0.3µg/L，0.9µg/L，2.7µg/L，8.1µg/L
3. 酶标记物12mL ………………………………………………红色帽
4. 克仑特罗抗体工作液 7mL …………………………………绿色帽
5. 显色液 A液 7mL ……………………………………………白色帽
6. 显色液 B液 7mL ……………………………………………红色帽
7. 终止液（7mL）………………………………………………黄色帽
8. 20X浓缩洗涤液40mL
六、所用仪器、试剂
1、仪器：
酶标仪450nm/630nm
旋转蒸发仪
组织均质器
振荡器
离心机
20µL-200µL微量加样器、100µL-1000µL微量加样器
2、试剂：
甲醇
氢氧化钠
正己烷（或正庚烷）
磷酸二氢钾
Tris
七、溶液的配制
1. 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20比例稀释，临用前配制。
2. 0.05M盐酸液： 取盐酸4.2mL，加水至1000mL。
3. 0.05M磷酸盐缓冲液（pH3.0）：称取磷酸二氢钾6.8g，加水900mL，用稀磷酸调节pH至3.0，用水稀释至1000mL。
4. 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 3.0)： 称取磷酸二氢钾68g，加水900mL，用磷酸调节pH至3.0，用水稀释至1000mL。
八、样本前处理步骤
1. 猪组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法
1.1 5.0g粉碎的样品与25mL 50mM HCL混合，振荡1.5h，以达到均质的目的；
1.2 称6g均质物（相当于1g组织），加入离心瓶中；
1.3 10~15℃，3000g以上的转速离心15min；转移上清液到另一个离心瓶中，加300µL 1M NaOH混合15min；
1.4 加入4mL 500mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0，简单的混合后在4℃保存，至少1.5h或过夜（非常重要）；
1.5 10~15℃, 3000g以上的转速离心15min，分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20~24℃），然后用RIDA C18柱纯化。
2. 尿样本处理方法
取20µL清亮尿样直接测定(如果尿样浑浊一定要过滤或离心5 min直至得到清亮尿样)，暂不使用的样品应冷冻保存。
九、操作步骤
1. 使用前将试剂盒置于室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃不要冷冻；
2. 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔；
3. 反应：往酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液20 µL，然后加入克仑特罗抗体工作液80 µL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。
4. 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250µL洗涤液，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。
5. 酶标记物：加入酶标记物100µL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次；
6. 显色：每孔加入A、B底物液各50µL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min；
7. 测定：每孔加入终止液50µL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。
十、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含克仑特罗成负相关。
1. 定性判定：
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围（µg/L）。假设样品1的吸光度值为0.6，样品2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0µg/L为1.500；0.1µg/L为1.380；0.3µg/L为1.200；0.9µg/L为0.900；2.7µg/L为0.700；8.1µg/L为0.400。则样品1的浓度范围是2.7µg/kg~8.1µg/kg；样品2的浓度范围是0.3µg/kg~0.9µg/kg。
2. 定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以克仑特罗标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
十一、灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度： 0.1µg/L，标准曲线IC50在0.25~0.56µg/L范围之内。
试剂盒的变异系数：小于25%。
试剂盒准确度：样本回收率均在55％~120％之间。
样本最低检测限：
猪尿………………………………0.24µg/L
猪肉………………………………0.22µg/kg
猪肝………………………………0.21µg/kg
十二、注意事项
1、 用之前将所有试剂温度回升至室温20~24℃。
2、 用之后立即将所有试剂放回2~8℃冰箱。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。
4、所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
5、室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。
6、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
7、剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
8、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
9、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
10、用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
11、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。
十三、储藏条件和保存期
储藏条件：试剂盒于2~8℃保存，不要冷冻。
保存期：该产品有效期为6个月。
十四、供应商名称、地址
供应商：北京望尔生物技术有限公司
地址： 北京市海淀区圆明园西路2号
