一、概要

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是应用广泛的抗菌素，曾对畜禽疾病控制和治疗起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能引起人的再生性障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。我国农业部第235号文规定动物性食品中氯霉素残留限量为不得检出。由于气相色谱等仪器分析方法样本前处理及测定操作烦琐和费用高，推广使用受到限制。ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器化程度低和样本前处理相对简单等优点，适于现场监控和大量样本筛查。

二、原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氯霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物氯霉素的含量。

三、使用范围

用于定量、定性检测鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾、蜂蜜中氯霉素的残留量。

四、交叉反应率

氯霉素……………………………100%

棕榈氯霉素  ……………………＜0.1%

甲砜氯霉素………………………＜0.1%

氟甲砜霉素………………………＜0.1%

已酰氯霉素………………………＜0.1%

五、试剂盒的组成

每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：

1.    氯霉素96孔酶标板 1块

2.    标准液6瓶，1mL/瓶，为CAP标准溶液： 0µg/L、0.05µg/L、0.15µg/L、0.45µg/L、1.35µg/L、 4.05µg/L

3.    酶标记物12mL………………………………………………红色帽

4.    氯霉素浓缩抗体 0.8mL…………………………………… 绿色帽

5.    显色液 A液 7mL……………………………………………白色帽

6.    显色液 B液 7mL……………………………………………红色帽

7.    终止液（2M硫酸）7mL  …………………………………黄色帽

8.    20X浓缩洗涤液40mL ………………………………………透明帽

9.    2X浓缩复溶液50mL  ………………………………………透明帽

六、所用仪器、试剂

1. 仪器：

微孔板酶标仪450/630nm

旋转蒸发仪

组织均质器

振荡器

离心机

20mL-200mL、200mL-1000mL微量加样器

2. 试剂：

乙酸乙酯

乙腈

正己烷

三氯甲烷

蒸馏水

七、溶液的配制

 1.  稀释复溶液：将2X浓缩复溶液摇匀，用水以1：2比例稀释，临用前配制。

2.  稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20比例稀释，临用前配制。

3.  稀释抗体溶液：将11X浓缩抗体溶液摇匀，用复溶液将浓缩抗体按1:11比例稀释，临用前配制。

八、样本前处理步骤

1．鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾样本处理方法

1.1 称3g±0.1g均质后的样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，振荡10min，室温3000g以上，离心10min。

1.2 取出4mL上层液体（相当于2g的样品）在50~60℃氮气流下干燥。

1.3 加入1 mL正己烷溶解干燥的残留物，再加1mL复溶液强烈振荡1min，室温3000g，离心5min。

1.5 去除上层相，取下层水相50 mL进行分析。

2. 蜂蜜样本处理方法

2.1 取2g蜂蜜，放入离心管中，用4mL去离子水溶解。

2.2 加入4mL乙酸乙酯上下震荡10min。

2.3 室温3000g以上离心10min。

2.4 移取1mL上层乙酸乙酯（相当于0.5g样品）到另一离心管中， 60℃氮气流下蒸干。

2.5 残留物用稀释后的复溶液0.5mL溶解。

2.6 取50 mL进行分析。

九、检测步骤

1. 使用前将试剂盒置于室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2. 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃不要冷冻。

3.      编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。

4. 反应：往酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液50 µL，然后加入已稀释好的氯霉素单克隆抗体50 µL，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应60min。倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250µL洗涤液，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。加入酶标记物100µL，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。

5. 显色：每孔加入A、B底物液各50µL，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色30min。

6. 测定：每孔加入终止液50µL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。

十、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氯霉素成负相关。

1.    定性检测

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围（µg/L）。假设样品1的吸光度值为0.6，样品2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0µg/L为1.500；0.05µg/L为1.330；0.15µg/L为1.100；0.45µg/L为0.801；1.35µg/L为0.470；4.05µg/L为0.212。则样品1的浓度范围是0.45 -1.35µg/kg；样品2的浓度范围是0.15 -0.45µg/kg。

2. 定量测定　

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0µg/L标准溶液的平均吸光度值

以氯霉素浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度: 0.07µg/L，标准曲线IC₅₀在0.30µg/L ~0.60µg/L范围之内。

试剂盒变异系数：小于25%。

试剂盒准确度：样品的回收率范围在55.0％~100.0％之间。

样本最低检测限：

鸡肉……………………………… 0.06µg/kg 

鸡肝……………………………… 0.06µg/kg 

虾………………………………… 0.08µg/kg 

蜂蜜……………………………… 0.06µg/kg 

十二、注意事项：

1、使用之前将所有试剂温度回升至室温20~24℃。

2、使用之后立即将所有试剂放回2~8℃冰箱。

3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。

4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

5、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。

6、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。

7、试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

8、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

9、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

10、保存试剂盒于2~8℃，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

11、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。

十三、储存条件及保存期

储存条件：保存试剂盒于2~8℃。

保存期：该产品保存期为6个月。

十四、供应商名称、地址

供应商：北京望尔生物技术有限公司

地址：北京市海淀区圆明园西路2号