一、概要
玉米赤霉醇（zeranol，ZER），属于雷索酸内酯类非甾体同化激素。ZER作为牛羊促生长剂，以耳根埋植的形式应用，促进蛋白质的合成，能提高胴体瘦肉率及饲料转化率。但是，玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，在动物尿液中的残留会引起人体性机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，还可能致癌。ZER排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染。1998年欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖，我国农业部第235号公告明确规定玉米赤霉醇禁用于所有食品动物，所有可食动物尿液不得检出。我国尚未制订动物性食品中玉米赤霉醇残留检测的行业标准。由于玉米赤霉醇作为牛羊增重剂效果好，经济回报高，仍有违法使用的现象。目前国际上动物性食品中玉米赤霉醇残留仪器检测方法主要有液－质联机和气－质联机法，但这两种仪器方法前处理复杂，检测时间长，需要昂贵的仪器设备。酶联免疫快速检测法（ELISA）具有灵敏度高，特异性强，仪器化程度低和样品前处理相对简单等优点，特别适于玉米赤霉醇现场监控和大量样本筛查。
二、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物玉米赤霉醇将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争玉米赤霉醇抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物玉米赤霉醇的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物玉米赤霉醇的含量。
三、使用范围
用于定量、定性检测牛尿中玉米赤霉醇的残留量。
四、交叉反应率
α-玉米赤霉醇 ………………………100.0%
β-玉米赤霉醇 ………………………36.3%
α-玉米赤霉烯醇………………………52.7%
β-玉米赤霉烯醇………………………0.7%
玉米赤霉酮 ………………………74.4%
玉米赤霉烯酮的………………………53.7%；
与己烯雌酚 ………………………＜0.1%
雌二醇 ………………………＜0.1%
睾酮……………………………………＜0.1%、
克伦特罗………………………………＜0.1%。
五、试剂盒组成
每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：
1. ZER 96孔板酶标板 1块
2. 标准液6瓶，1ml/瓶，为ZER标准溶液：0µg/L、0.5µg/L、1µg/L、2.5µg/L、5µg/L、10µg/L
3. 酶标记物12ml………………………………………………红色帽
4. 玉米赤霉醇抗体 7ml……………………………………… 绿色帽
5. 显色液 A液 7ml……………………………………………白色帽
6. 显色液 B液 7ml……………………………………………红色帽
7. 终止液（7ml）：2M硫酸 …………………………………黄色帽
8. 20X浓缩洗涤液40ml
9. 2X浓缩复溶液40ml
六、所需仪器试剂材料
1. 仪器
微孔板酶标仪（配备450nm和630nm滤光片）。
微量振荡器
离心机：转速应满足6000转/分。
微量移液器：单道20ml、50ml、100ml、1000ml；多道250µl。
天平：感量0.01g。
氮气吹干装置。
2. 试剂
蒸馏水
甲醇 分析纯
醋酸钠 分析纯
醋酸 分析纯
C18固相萃取柱 RIDA No.:R2002
七、溶液的配制
1. 醋酸钠缓冲液：取0.41g醋酸钠，定容至100ml，调pH至4.8。
2. 40％甲醇：取无水甲醇，用去离子水以1：4倍稀释（1v无水甲醇＋3v水）
3. 80％甲醇：取无水甲醇，用去离子水以1：84倍稀释（1v无水甲醇＋7v水）
4. 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用去离子水以1：20的比例稀释，临用前配制。
5稀释复溶液：将2X浓缩复溶液摇匀，用去离子水以1：2的比例稀释，临用前配制。
八、样本前处理步骤
1. 尿样本处理方法
取适量新鲜或解冻后的供试尿液，6000g离心10min，取上清液过0.45mm滤膜，样品备用。
2. 样品净化
2.1 取500ml备用尿液加入3ml 50mM（pH4.8）的醋酸钠缓冲液。
2.2 加入8ml β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶，涡动30s，37℃恒温箱中静置3h。
2.3 用3ml无水甲醇活化C18柱，流速控制在1滴/秒。
2.4 用2ml 50mM（pH4.8）的醋酸钠缓冲液活化C18柱。
2.5 加入500ml提取后样品。
2.6 用2ml 50mM（PH4.8）的醋酸钠缓冲液洗涤C18柱。
2.7 用3ml 40%的甲醇溶液洗涤C18柱，正压吹干。
2.8 用1ml 80%的甲醇溶液洗脱并收集滴出液，正压吹干滴尽后的C18柱，以收集完全。
2.9 用氮气吹干装置将收集瓶60℃吹干。
2.10 向吹干后的收集瓶中加入500ml复溶液，涡动30s。
2.11 检测时，取50ml样品。
九、操作步骤
1. 将试剂盒从4℃冷藏环境中取出并将所需试剂从盒中取出，置于室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2. 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃，不要冷冻。
3. 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。
2. 向酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液50 ml，然后加入玉米赤霉醇单克
隆抗体工作液50 ml，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应1h。
5. 倒出孔中液体，每孔加入250ml洗涤液，30秒后倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。如此重复操作共洗板5次。
6. 加入酶标记物100ml，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应1h。取出酶标板，如前述洗板5次。
7. 显色：每孔加入底物显色液A、B各50ml，轻轻振荡混匀，室温避光显色10min。
8. 测定：每孔加入终止液50ml，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。
十、结果判定
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以玉米赤霉醇标准品浓度（µg/L）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中玉米赤霉醇实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
十一、检测方法的灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：试剂盒灵敏度为0.60µg/L，标准曲线IC50在1.37µg/L～
3.01µg/L范围之内；
试剂盒精密度：变异系数小于25% ；
试剂盒准确度：回收率范围在70％～110％之间；
样本最低检测限：牛尿………………………10.1µg/L。
十二、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20~24℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、试剂盒于2~8℃保存，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；由于标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。
8、标准的吸光度值小于0.6个单位（OD450nm<0.6 ）时，表示试剂可能变质。
9、加A、B 液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30min。
十三、储藏条件和保存期
储藏条件：试剂盒于2~8℃保存，不要冷冻。
保存期：该产品保存期为6个月。
十四、供应商名称、地址
供应商：北京望尔生物技术有限公司
地址： 北京市海淀区圆明园西路2号
