犬、猫狂犬病灭活疫苗
Quan、Mao Kuangquanbing Miehuoyimiao
Canine and feline Rabies Vaccine，Inactivated
本品系狂犬病病毒PasteurRIV株接种BHK-21克隆CT细胞系培养，收获感染病毒液,
经β-丙内酯灭活后，加入磷酸铝(Al P04)佐剂制成。用于预防犬、猫狂犬病。
【性状】 红色到浅紫色，底部有无色沉淀物，轻轻振摇后呈均匀悬液。
【无菌检验】 按现行《中国兽药曲》附录进行检验，应无菌生长。
【安全检验】用8～16周龄健康敏感犬2只，各皮下注射疫苗2ml （含2头份)．观察21日，应不出现由疫苗引起的明显的全身或局部反应。
【效力检验】 按照附注1进行。与参考疫苗相比，每头份应≥2.OIU。
【铝离子含量测定】 按照附注2进行，应为O.66±0.22mg/ml。
【规格】 (1) 1头份/瓶(2)10头份／瓶
【贮藏与有效期】 2～8℃保存，有效期为48个月。
【生产企业】 英特威国际有限公司
【附注】 1效力检验方法
1.1材料
1.1.1无菌PBS。
1.1.2狂犬病参考疫苗。
1.1.3 3～4周龄、体重11～15g的雌性瑞士小白鼠。
1.1.4无菌，带有针头的0.5ml刻度注射器（用于接种）。
1.1.5 注射用水。
1.1.6 无狂犬病抗体的马血清。
l.1.7 CVS-27狂犬病攻毒标准品。
1.1.8 无菌，带有针头的10ul刻度注射器（用于攻毒）。
1.2 方法
1.2.1 免疫接种
1.2.1.1将待检疫苗和参考疫苗PBS按表-1系列稀释成1：1、1：3、1：9、1：27和1：81。在室温下保存待用。
1.2.1.2 每批待检疫苗用64只小白鼠，用下列稀释度的疫苗进行腹腔接种，每只0.5ml（试验设计参见表-2）。
表-1待检疫苗和参考疫苗稀释方法
|
数量(只) |
稀释度 |
待检疫苗／参考疫苗+PBS |
|
10 |
1：l |
不稀释 |
|
14 |
1：3 |
5(不稀样)ml+10m1 |
|
16 |
1：9 |
5(1：3)ml+10m1 |
|
14 |
1：27 |
5(1：9)ml+10ml |
|
lO |
1：81 |
5(1：27)ml+10ml |
|
|
|
|
1.2.1每次检验留取40只小白鼠作为不按种的攻毒对照(参见表-2)。
1.2.2攻毒注射：接种14日后，将小白鼠麻醉，脑内攻毒，每只30ul。
l.2.2.1攻毒前，用含有2%马血清的灭菌注射用水CVS-27狂犬病攻毒标准品稀释至100LD50/30ul(此时的稀释度为100)。用含有2％马血清的灭菌注射用水继续稀释为10-1、10-2、10-3
。冰水中保存待用：
1.2.2.2 按照从10-3到100的顺序注射20只对照组小白鼠，每个稀释度5只，作为攻毒
前的攻毒对照(试验设计参见表-2)；
1.2.2.3用100稀释度对所有免疫鼠(待检疫苗和参考疫苗)进行攻毒(试验设计参见表-2)；
1.2.2.4 按照从10-3到100的顺序注射20只对照组小白鼠，每个稀释度5只，作为攻毒
后的攻毒对照(试验设计参见表-2)；
1.2.3 每日观察小白鼠的痉挛、瘫痪或死亡情况，共观察14日。记录死亡率。
1.2.3.1攻毒前死亡的小白鼠为非特异性死亡，在进行计算时不予考虑;
1.2.3.2攻毒后96小时内的死亡为非特异性死亡，在进行计算时不予考虑;
1.2.3.3在攻毒4日后发生死亡或在观察期末存活但表现痉挛或瘫痪的小白鼠，为不保护。
试验设计
|
样品 |
疫苗稀释度 |
小白鼠数量 |
强毒稀释度 |
|
待检疫苗 |
1：1
1：3
1：9
l：27
1：Sl |
10
14
16
14
lO
|
100
100
100
100
100
|
|
参考疫苗
|
l：1
1：3
1：9
l：27
1’81 |
10
14
16
14
10 |
100
100
100
100
100 |
|
攻毒前的攻毒对照
|
不接种疫苗
不接仲疫苗
不按种受苗
不接种疫苗 |
5
5
5
5 |
100
10-1
10-2
10-3 |
|
攻毒后的攻毒对照
|
不搂种疫苗
不接种疫苗
不接种疫苗
不接种疫苗 |
5
5
5
5 |
100
10-1
10-2
10-3 |
1．3计算
在计算时，将不保护的免疫鼠计为阴性，不保护的对照鼠计为阳性。疫苗的PD50和攻毒用强毒的LD50按照PROBIT分析法和Spearman—Karber公式来计算，其价值以滴度表示。疫苗的效力则以与参考疫苗相比的IU表示，其计算公式如下：
X=待检疫苗的PD50/参考疫苗的PD50×参考疫苗的IU
l.4试验要求
试验结果应符合下列要求，则有效：
在攻毒后96小时内，每组死亡率≤20%；
攻毒用强毒的病毒量≥10 LD50
参考疫苗的PD50应在所用稀释度范围内。
测试的可信区间在预测效力的25％～400％范围内：
回归线的直线性和平行性(根据PROBIT分析法计算)>O.05。
如果检验无效，则需要重复进行检验。如果一批疫苗未通过初检，可以重检一次。
2 铝离子含量测定方法
2.1 材科
2.1.1 硫酸(17.8mol/L)
2.1.2 硝酸(15.8mol/L)
2.1.3 氢氧化钠浓溶液(14.4mol/L)
称取400g氢氧化钠,慢慢加到800ml水中，边加边连续搅拌。溶于蒸馏水稀释定容至
1000ml。在塑料容器中室温保存。
2.1.4 0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液
称取8g乙二胺四乙酸二钠盐，加热溶于800ml水中，冷却，定容至1000ml,摇匀。
2.1.5 0.2 mol/L醋酸盐缓冲液(pH值4.4)
取0.2mol/L醋酸(O.60lml/50m1)30.5ml；0.2mol/L醋酸钠(1.361g/50ml)19.5ml,
混合摇匀。
2.1.6 0.l％甲基橙溶液
称0.lg甲基橙，溶于70℃的蒸馏水中，冷却，定容至100ml。
2.1.7 0.02 mol/L硫酸铜溶液
将5克硫酸铜(CuS04·2H2O溶于水中，加4~5滴硫酸，定容至1000ml，摇匀。
2.1.8 0.1% 1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)溶液
称取O.lg PAN，溶于100ml乙醇中。
2.2 方法
2.2.1 矿化
在一个烧瓶中加入待滴定的含铝溶液（铝含量少于6mg），加入1.0ml硫酸，0.1ml硝酸溶液和一些玻璃珠。矿化至浓白烟生成。如发生炭化，加数滴硝酸溶液，并加热至颜色褪尽。冷却。
2.2.2 中和
小心加入10ml水，煮至溶液澄清。冷却。加入0.05ml甲基橙溶液。以浓氢氧化钠溶液中和（用滴定管）。如形成沉淀物，逐渐加入稀硫酸溶液，使之溶解。
2.2.3 滴定
将溶液转移至一个250ml锥形瓶中，并用25ml水清洗烧瓶。精确加入25ml0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，再加入10ml醋酸盐缓冲液(pH值4.4)，煮沸3分钟。
然后加入0.1mlPAN溶液。用0.02mol/L硫酸铜溶液对上述热溶液进行滴定，直至颜色变为暗紫色。
2.2.4 对照
用蒸馏水替代含铝溶液，进行相同操作。
滴加的0.02mol/L硫酸铜溶液的量须接近25mL；否则，应核对0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液与0.02mol/L硫酸铜溶液的比例。
2.2.5 假设实验组中加入x ml的0.02M硫酸铜溶液，而对照组中加入t ml的0.02mol/L硫酸铜溶液。则与铝离子螯合的0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液为（t-x）ml，
1ml0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液相当于0.5396mg铝，故待检溶液中的铝含量为0.5396（t-x）mg。
